第23卷第2期河北医科大学学报Vol.23　2No.　　2002年3月?117?综?　述?DNA结构多态性在法医血液遗传学中的应用闫玉仙丛斌审校综述　　河北医科大学基础医学院法医学教研室(石家庄0)　主题词DNA;调控序列,核酸/遗传学;法医学;血液学　中图号D919.2　法医血液遗传学是应用分子遗传学的理论及技术研究并解决司法实践中的血液及其它组织标本的司法鉴定的一门法医学分支学科。其研究范围包括遗传物质的本质、遗传物质的传递及遗传信息的实现,所采用的技术为DNA多态性分析技术,即利用遗传标记的多态性对生物检材进行种类、、种属表型的鉴别及亲子鉴定。遗传标记的发展大致可以分为限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP)、变数目串联重复可(variablenumbertandemrepeat,VNTR)(主要指小卫星DNA),短串联重复(shorttandemrepeat,STR)(主要指微卫星DNA)三个阶段。过去常用的遗传标记是红细胞血型、红细胞酶型、血清蛋白型、唾液蛋白型及人类白细胞抗原系统等。但这些遗传标记有共同的缺点,①多态信息量(polymorphisinformationcontent,PIC)少;②它们在基因表达过程中受许多因素的影响,导致不能正确反映编码区的多态信息;③某些血型系统存在生理性变异,使判型错误;④这些遗传标记常为蛋白质、多态及糖基侧链,易受环境中各种理化因素的影响而失活,影响检测结果。1985年Jeffreys博士[1]成功的建立了DNA指纹技术并首次将DNA指纹图技术应用于法医学检验鉴定中,解决了一宗移民纠纷案,使法医物证检验实现了个体排除到个体认定的飞跃,标志着法医物证检验技术,由蛋白质水平进入到基因水平。自DNA分子杂交技术和PCR技术问世以来,国内外法医界将DNA技术应用于法医学个体识别和亲子鉴定,使法庭科学对犯罪生物物证的个人识别能力和亲子鉴定的研究有了突破性的进展,取得了令人瞩目的成就。1DNA多态性分析技术的回顾1.1DNA指纹技术:人类DNA高度多态性的第一武警医学院中心实验室(在读研究生)个小卫星区域是1980年Wyman和White[2]在人类的DNA基因库随机片段中偶然发现的,进而又发现了许多其它小卫星区域。这些区域是由十几个到几十个碱基的“核心序列”串联重复构成,重复次数一般在6～100次之间,Nakamura[3]以VNTR对此命名。DNA指纹多态性技术采用的是Southren印迹杂交,选用合适的限制性内切酶切割小卫星区域两侧的串联重复,将酶切后的DNA经琼脂糖凝胶电泳后转印到硝酸纤维膜或尼龙膜上与小卫星探针杂交,然后通过放射自显影或显色技术获得Southren印记图谱。此后,DNA指纹技术广泛用于法医学的个人识别和亲子鉴定,并且已有许多成功的案例。如1985年Jeffreys利用DNA指纹技术成功地解决了一件移民案件的父权鉴定问题。但是DNA指纹技术要求的条件较高,操作过程复杂,因此在法医鉴定中有很大的局限性。随着PCR技术的问世,使检测核心序列在十几到几十个碱基的可变数目重复(PCR2VNTR)有了进一步的发铡NTR位点多态性:数目可变的串联重复主要为小卫星DNA(MinisatelliteDNA)[4,5]是血液遗传学中较常用的遗传标记。小卫星DNA存在于某些染色体的近端粒和着丝粒区,由十几至几十个bp长度单位组成,串联重复次数由几次到数百次不等,除了有串联重复次数的变异外,重复单位组成也略有变异。VNTR序列具有杂合性高、种类多、遗传稳定的优点,是理想的遗传标记,并在法医学领域得到广泛的应用,目前常用的VNTR位点有D1S80,COL2A1,3AP013,D4S95,DXS52(st14),D17S30(D17S5),HUMFOLP23等。随着VNTR位点的不断发现,在法医学实践和遗传学研究中人们采取多个VNTR位点联合应用技术。Peston等在调查加里西人群DNA多态性时采用多个位点共同检测,使个体识别率高达0.999。但VNTR多态性分析也有其不足之处,①要求检材?://?118?第第河北医科大学学报　　23卷　2期中DNA未被严重降解;②由于VNTR核心序列较引物的浓度,增加dNTP和Taq酶的用量,必要时需长,导致PCR反应时杂合的长短等位基因片断扩增要调整模板DNA的量。在选择引物时,引物与引效应不一致,从而造成判型错误。1989年Litt和物之间以及引物与目的DNA以外的DNA区的亲Juty,Weber和May在研究心肌肌动蛋白基因时,各和力要小,同时还要照顾不同位点的扩增条件,所采自用PCR扩增测序凝胶分析的方法,在人类基因组取的方法必须可靠,可重复性好,DP值>0.9,观测中,检出一些长度差异在2bp的DNA片段。同年杂合度>70%,扩增产物的长度在90～500bp之Edwards等应用DNA测序方法分析“自毁容貌综合间。征”患者的基因突变时,首次发现3个或4个碱基为2.2　复合扩增技术及其在法医学中的应用:STR重复单位构成的串联重复,这类遗传标记称为短串位点,即微卫星PCR扩增片段长度多态性,从一开联重复(shorttandemrepeat,STR),作为遗传标记始就受到法医学界的广泛重视,因为它具有以下特STR更优越于VNTR。点:①STR位点PCR扩增的成功率和灵敏度都很1.3STR位点多态性:人类基因组的基因及基因高,尤其适用于降解的DNA检材PCR分型。因为外区域的编码区和非编码区[6]含有2～4bp的短串在法医学实际检案中遇到的检材多半是降解较严重联重复序列。如GACA、TA、、等是多态GATCCCA的,当降解到500bp以下时,无论是RFLP,还是性最为丰富的串联重复DNA家族,其多态性现象VNTR位点PCR分型都很困难,而STR核心序列的产生与VNTR原理相同,都是由重复单位数目的短,在降解的检材中还可能存在STR位点,所以改变,使不同等位基因的DNA片段长度不同,进而STR2PCR进行分型的成功率就比较高;②当两个等表现出多态性。人类基因组中平均每15Kb就存有位基因片段长度相差较大时(>200bp),片段短的1个STR基因座,为法医个人识别和亲子鉴定提供会出现优先扩增,从而引起判型错误。STR位点的了高信息基因座的丰富来源。重复单位短,等位基因的差异小,如HUMTH01位目前已发现STR位点大约有7000个,其中绝点,共有6个等位基因,其重复单位有4个碱基,最大多数显示出高度杂合性,PCR扩增成功率高,适长与最短的仅差20bp,所以STR复合扩增,可以避用于微量和腐败生物检材的DNA分型,如今已成免分型错误;③为了使所检STR基因PIC大,杂合为个人识别和亲子鉴定的重要手段。Edwards等应度高,提高有限检材的利用率和检出速度,可以复合用DNA测序的方法分析“自毁容貌综合征”患者的扩增几个多态性位点;④操作方法上,可以使用多重基因突变时首次发现了2～4bp为重复单位构成的PCR来简化分析,引物设计在24bp左右,(GC)含短串联重复[7]。在实际的检案中发现STR单个位量约50%,因此,所有的扩增反应都有相近的Tm点,无微变异体(microvariant)或微变异体少,基因值。正是这些优点,使许多法医学者转向这方面的突变率和杂合度低及提供的信息量均不及VNTR,研究。使得STR系统的应用有了限制。要想改进这些不1992年德国学者Brinknam等人[10]首先对足可以通过检测多个STR位点的多态性。DNA降解较为严重的尿样检材进行了两个STR位点和三个VNTR位点扩增分型,结果对长序列2法医物证中DNA技术的研究进展VNTR扩增失败的检材用STR位点复合扩增却十Southern杂交技术和大量的VNTRs位点的发分有效。随后,Kozma[11]和Stein[12]等陆续报道了5现使DNA作图广泛应用到个体识别及亲子鉴定个位点在德国人群中的等位基因频率及在法医学中上,于是VNTR很快取代了以往的HLA分型。目应用的情况;同时英国的GillP[13]也先后对5个位前又发展到应用微卫星DNA多态性来进行个体识点群体遗传学数据及其在法医学中的应用进行了研别和亲子鉴定。究。这些研究证明,此项技术非常适合于法医的物1989年,LittLutyTautzWeberMary和侯一平证学检验。[8]等连续报道了STR基因座的应用,STR基因座目前已发现的STR基因座应用于法医学实践在人类学、法医学等领域不断显示出重要的应用价的大约有20多个,见表1,复合扩增包括双基因座值。1991年Edwards[9]等报道了STR多基因座的(duplexing),三基因座(triplexing),四基因座复合扩增。(quadriplexing),六基因座(hexaplexing),七基因座2.1复合扩增应遵循的原则:复合扩增时,因不同九十三等基因座位复合扩(heptaplexing)以及八、、的基因座可以在同一PCR条件下扩增,所以需调整增[14]。在扩增微卫星DNA时,尽管人们首先发现?://河北医科大学学报　　23卷　2期第第?119?的是二核苷酸微卫星DNA,但现在人们正把目光越Eetrala[17]等用此系统报告了西班牙人的基因分布来越多地投向三核苷酸微卫星DNA和四核苷酸微资料,得出结论PD=0.995、=0.933,高于单个PE卫星DNA。三核苷酸微卫星DNA和四核苷酸微卫位点的分析,说明此系统是一个多态性很好的系统。星DNA也显示出二核苷酸微卫星DNA那样的多多个STR基因座位复合扩增系统用于人类研态性,但更易检测,且电泳图谱上没有二核苷酸微卫究的调查资料已见诸报道,利用群体遗传学调查所星DNA常常产生的复合带。Edwards等研究表明获得等位基因及基因型频率,计算出的杂合度和遗三核苷酸和四核苷酸重复顺序比二核苷酸重复顺序传多态信息量,为法医学的个人识别和亲子鉴定奠变异性更高且扩增更忠实。定了必要的基础。美国血库协会(American表1　STR基因座的特征AssociationofBloodBanks,AABB)规定最低否定父等位基因大小权的平均概率大约是95%,若测得6个STR系统基因座染色体重复序列(bp)及其1个D1S80基因座,就能达到AABB标准。在ARXq11～12CAG195～225ARAXcen～q13AGC255～315进行个人识别的检案时,采用CTT系统(CSF1PO,～117TPOX,THO1)CTTV(CSF1PO,TPOX,THO1,FABP4q31AAT214～238IID6CAG185～206VWA)FFFL(F13A01,FES/FPS,F13B,LPL)最终PLA2A112q23～qterAAT118～139都达到了满意的效果。同时美国FBI推出指定TRM16p23～q12AAC174～186ACTBP26AAAG231～339STR办案系统,AMPFISTR[18],分辨率达10-6;ACPP3q21～qterAAAT260～280AMFP[19],分辨率可达10-10。由此可见,STR位点～q34AGAT291～327CYP1915q21～q31AAAT173～201的复合扩增克服了以往的PCR2VNTR分型及单个D5S8185q21～q31AGAT119～151STR2PCR的缺点。相信在不久的将来,会有更多的D6S5026TCTA152～210D7S8207qAGAT212～244STR位点复合扩增运用于法医实践中。D8S5028TCTA152～210考文献参　　D11SAAAG176～225D13Sq22～31AGAT165～,WilsoV,TheinSL,“minisatel”D16Sq24～qterAGAT264～,1985,314(4):～,～147ProcNatlAcidSci,1980,77(8):6754D21S1121TCTA172～264FES/FPS15q25～qterAAAT222～,LeppertP,ConnellB,～～,F13A016q24～25AAAG281～,235(5):1616FIBRA4q28AAAG256～,RichardsB,～～303NuclAcidsRes,1989,17(5):2140LPL8p22AAAT105～1335.WuS,SeinoS,,～203(COL2A1)gene:VNTRpolymorphismdetectedbygeneTPOX2p23～qterAATG224～,1990,18(7):3102VWA12p12～pterAGAT127～,Kimpton,PeterGill,　随着研究的不断深入,这方面的报道也越来越,1993,106(3):13多,如三基因座D5S818、D13S317及D7S820是,等人于1995年建立的一个四核苷酸复合andanalysisofmutations:,1989,202(2):185扩增系统,其多态性好,杂合度高,已广泛用于人及8.侯一平,苟清,Michaels,等.人类短串联序列HUMTH01基因座动物的法学鉴定中,在加拿大土著人群这三个位点位的遗传多态性.遗传学报,1996,23(3):174的累计识别率是0.999。JinLi[15]等还用此扩增系,CivitelloA,HammondHA,s.AmJ统对人类和非人类灵长动物的基因,作了系统的比HumGenet,1991,49(4):746较,为人类的进化和移栖动物群的研究提供了宝贵,ButlerR,LincdnP,的资料。Sprecher等[16]建立的三基因座D16S539、recommendationsoftheDNAcommissionoftheinternationalsocietyforforensichaemogeneticsrelatingtotheuseofDNAD7S820及D13S317(SilverⅢ,1992,52(3):,WI),由于它具有扩增产物片段大小,NagaiA,WollerJ,lociHUMFIBRA不重叠,可用PAGE银染分析,所需用实验经费少等优点,如今已广泛的运用于法医鉴定中。CarmenLegalMed,1998,111(2):103?://?120?闫玉仙等DNA结构多态性在法医血液遗传学中的应用,LangeT,FrencikS,,tetramericshorttanclemsrepeatslociD3S1744D12S1090and1996,20(4):,1998,91(2):.CarmenEntralaM,JoseA,LorenteMD,,“multiplex”popul(SilverSTRⅢTMMultiplex),1993,62(3):116JournalofForensicscience,1999,44(5):.AlforedRL,HammondHA,CotoI,,LicB,ManfredH,,1994,55(2):190PCRAmplicationKitJournalofForensicSciences,1998,30(5):15.JinL,UnderhillPA,BuoncristianiMR,,MartinR,,1996,23(7):,1997,42(11):.SprecherCJ,PwersC,LinsAM,(2000-07-11收稿)?临床研究?股骨干骨折合并同侧股骨颈骨折漏诊6例临床分析齐向北赵昌平李增炎河北医科大学第三医院创伤急救中心(石家庄0)　主题词股骨骨折/并发症;股骨颈骨折/诊断;误诊中图号　R683.42　1992年5月～2001年8月治疗股骨干骨折合并同侧股骨颈骨折15例,其中漏诊6例,现报告如下。临床资料1　　　1.1一般资料:漏诊6例患者男性5例,女性1例;年龄22～54岁,平均38岁;右侧4例,左侧2例。致伤原因:车祸伤5例,高处坠落伤1例。股骨干骨折部位均在中段,6例为闭粉碎性骨折。股骨颈骨折基底型5例,中央型1例,其中合、Garden分型I型3例,Ⅱ型3例。合并同侧胫腓骨骨折1例漏诊情况:①2例股骨内固定术后1个月感觉患肢髋关节疼痛,X线片发现同侧股骨颈骨折;②例骨牵引治疗21个月后床旁X线片无意中发现;③例术后3个月X线片复2查股骨干骨折愈合情况时发现;④例术后3个月在进行患1肢功能锻炼时发现。讨2　　论2.1股骨干骨折合并同侧股骨颈骨折的发生率为5%～6%[1]。股骨干常为中段骨折,多为粉碎性,移位明显。而股骨颈骨折线常位于基底,多为线性,无移位。漏诊6例中,5例为股骨颈基底型,Garden分型为ⅠⅡ,Wolinsky等[2]～型报道股骨颈骨折26%～51%的骨折线为纵形,无或很少移温┱镌?文献报道,股骨干骨折合并同侧股骨颈骨折的漏诊率为19%～31%[3,4],本组为40%。漏诊原因是:①由于医师对此类损伤认识不足,忽略了全身及骨折临近关节如同侧髋关节的检查。②股骨颈骨折移位常常轻微,局部畸形不明显。在初期检查中约20%～30%的病例被忽视。Riemer等[1]注意到在股骨干骨折钢板内固定术后,同侧股骨颈骨折的漏诊率达30%。③X线片没有包括髋关节。④如患者为多发伤,病情重,主诉困难,股骨干骨折及开放性损伤,掩盖了髋关节症自し来胧?漏诊股骨颈骨折可造成严重后果,使后期处理十分困难,为了防止早期漏诊:①高度警惕创伤性股骨干骨折合并同侧股骨颈骨折的可能性;②首诊查体中要注意在髋部是否有压痛或叩击痛;③大转子、股骨干骨折照X线片时,常规包括股骨全长或骨盆平片,在可能情况下最好采用位摄片,以便观察股骨颈[5];④髋关节内旋15°必要时行骨盆CT检查,不仅可以明确有无隐匿型股骨颈骨折,而且可以观察骨盆内其它脏器有无损伤;⑤反复查体。进行全面系统的检查,有可疑情况应请各级医师会诊,以减少漏诊的发生。考文献参　　1.TerryS,Canale,主编.坎贝尔骨科手术学.第3卷.济南:山东科学技术出版社,1998..WolinskyPR,,1995,74(318):,ZinarDM,,1993,68(296):,1997,86(4):,HansenST,:(Am),1984,66(2):260(2001-08-21收稿)?://

文章来源：《中国实验血液学杂志》 网址: http://www.zgsyxyxzz.cn/qikandaodu/2021/0225/577.html